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　　第四节 基因重组与DNA克隆

　　一、基因重组

　　DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组或基因重组。重组产物称为重组DNA。DNA的重组广泛存在于各类生物。其功能：①在DNA损伤修复中起关键作用，没有重组，损伤和突变不会被消除。②重组和转座产生基因新的组合，供自然选择。③调节DNA表达。

　　20世纪60年代末，在细菌体内陆续发现一类能识别DNA的特异序列，且在识别序列内或附近切开DNA双链的核酸水解酶，称为限制性核酸内切酶（简称限制酶）。这类酶可将侵入宿主细胞的外源性DNA迅速切开，进而被脱氧核糖核酸酶水解，有防止病毒感染宿主细胞的作用。而对细菌自身的DNA则会通过甲基化酶在该种限制酶切位点的甲基化修饰而得到保护。所以，限制酶和甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统。

　　限制酶是一类重要的工具酶，到1999年10月已得到3154种，主要根据其来源菌株，依属、种、株三字母命名，若从同一微生物发现的多种限制酶，则依发现和分离前后的顺序用罗马数字表示。根据限制酶识别切割特性和催化条件有Ｉ、Ⅱ、Ⅲ型，重组DNA中常用的是Ⅱ型。限制酶只有限制性内切作用而无修饰功能，识别序列一般有4~6个碱基对，多数能识别廻文结构DNA序（具有二次旋转对称性）。例如大肠杆菌DNA限制酶EcoRⅠ的切口是交错的，产生能彼此配对的粘端（sticky end），切口是齐头的，产生平端（blund end）。由同一个限制酶切断得到的任何两个DNA片段的粘性末端都可以互相配对，再通过DNA连接酶连接，创建重组DNA分子。

　　1972年，美国学者Berg等人首次在体外把SV40（一种猴病毒）的DNA和噬菌体DNA用限制性内切酶分别切割，又将两者接在一起，成功地构建了第一个体外重组的人工DNA分子。

　　1973年，Cohen等人首次将体外重组的DNA分子导入大肠杆菌中，成功地进行了无性繁殖，从而完成了DNA体外重组和扩增的全过程。由此诞生基因工程这门新兴学科。

　　二、DNA克隆

　　克隆（clone）是指通过无性繁殖产生在基因型和表型上与亲代完全相同的子代群体。DNA克隆是指在体外对DNA分子按照既定目的分离、剪切和人工重组，然后将重组分子导入合适的宿主细胞，使其扩增的过程。

　　大部分外源DNA片段不能在细胞中自我复制，必须连到一个可以自主复制的载体（病毒或质粒DNA）上，然后转入宿主细胞复制。这样，外源DNA可以纯化形式重新获得大量拷贝。因在分子水平上操作，又称分子克隆。由于研究对象常是特异的基因片段，所以又称基因克隆。

　　基因载体（vector）是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内复制或表达的运载工具。其基本条件是：能自主复制并能带动插入的目的基因一起复制；具有一个以上的单一限制性酶切位点，以便目的基因插入；具有合适筛选标记（如抗药性基因，酶基因等）；载体分子量小，可插入较大的目的基因而不影响复制；在细胞内稳定性高，以便确保重组体稳定传代而不易丢失。

　　质粒（plasmid）是一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子。主要存在于微生物，细菌中含量最丰富。质粒控制多种不同的遗传性状，尤其与细菌的抗药性、致病性有关。

　　λ-噬菌体是一种大肠杆菌病毒，为线性双链DNA，它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称cos位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。λ-DNA在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。天然的质粒、噬菌体、病毒都需经人工改构才可为理想的载体。质粒、噬菌体常用于原核细胞为宿主的分子克隆，动物病毒常用于真核细胞为宿主的分子克隆。

　　三、聚合酶链式反应（PCR）

　　PCR是一种体外快速的特定DNA片段扩增技术。Mullis于1985年发明，其基本原理是根据DNA复制机制及DNA在体外随温度发生变性和复性的特点设计的。

　　一个PCR反应包括靶DNA（含目的DNA的样品）、引物（人工合成的与靶DNA的3′端序列互补杂交）、4种dNTP和热稳定的DNA聚合酶等。然后置高温950C（15~30秒）下使靶DNA变性解链，反应混合物被迅速冷却（单链DNA与引物结合的退火温度要认真计算，45~550C），再升高温度置70~750C左右，由TDNA聚合酶催化引物延伸合成子链。PCR的高温变性—低温退火—适温延伸三步反应反复循环，使靶DNA在两段引物限定范围内的序列以几何级数扩增。20个循环，起始DNA即扩增百万倍，30个循环后，扩增亿倍，全部所需时间不到1小时。PCR已广泛应用于生物学各个领域，如基因工程、DNA测序、筛选人类遗传疾病、病原微生物检测、法医学鉴定等。

　　概括起来，基因工程（genetic engineering）包括以下几个主要内容：

　　1.从复杂的生物体基因组中分离出目的基因片段。

　　2.在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。

　　3.将重组DNA分子转移到适当的宿主细胞（又称受体细胞），并与之一起增殖。

　　4.筛选出获得重组DNA的受体细胞克隆。

　　5.从筛选出的阳性克隆中提取扩增的目的基因片段，供研究。

　　6.将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之实现功能表达。